PANDUAN PRAKTIKUM – PEMBUATAN MEDIA NUTRIEN AGAR DAN STERILISASI

I. Tujuan

1. Untuk mengenal beberapa cara sterilisasi
2. Mengetahui macam-macam media dan pembuatannya
3. Memperoleh alat dan media yang steril

II. Dasar Teori

Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya baik yang mengganggu atau yang merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia, maupun mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2005).

Ketika anda pertama kali melakukan pemindahan biakan secara aseptik, sesungguhnya anda sudah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Sterilisasi adalah proses menghancurkan semua jenis kehidupan sehingga menjadi steril. Sterilisasi seringkali dilakukan dengan pengaplikasian udara panas. Ada dua metode yang sering digunakan, yaitu Panas lembab dengan uap jenuh bertekanan. Sangat efektif untuk sterilisasi karena menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya tembus kuat dan kelembaban sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel mikroba yang menyebabkan sel hancur. Suhu efektifnya adalah 121̊C pada tekanan 5 kg/cm2 dengan waktu standar 15 menit. Alat yang digunakan : pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan retort. Panas kering, biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-alat laboratorium. Suhu efektifnya adalah 160̊C selama 2 jam. Alat yang sering digunakan pada umumnya adalah oven (Hadioetomo, 1993).

Agar biakan murni dapat dibuat, medium harus steril sebelum inokulasi; yaitu kita harus yakin bahwa tidak ada organismehidup dapat berada dalam medium jika diinokulasi. Metode yang lazim digunakan untuk mensterilkan media ialah menempatkannya dalam otoklaf (sebetulnya panci masak bertekanan besar dan dielaborasi). Otoklaf menggunakan uap bertekanan untuk menaikkan suhu barang yang sedang disterilkan sampai suatu taraf yang mematikan semua bentuk kehidupan. Untuk sterilisasi rutin, otoklaf biasanya dioperasikan pada tekanan uap 15 lb/in2. Pada tekanan ini suhu menjadi 121̊C. Waktu yang diperlukan pada suhu ini adalah 15 sampai 20 menit. Apabila medium berukuran besar disterilkan, maka waktu yang diperlukan akan lebih panjang, karena panas memerlukan waktu untuk menembus bahan tersebut (Volk & Wheeler, 1993).

Metode sterilisasi secara fisik dapat dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat suhu yang tinggi atau tekanan yang tinggi. Cara kerja dari panas tersebut, bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim dan membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Daya bunuh panas kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan biakan mikroba dalam air mendidih akan cepat mematikan daripada dipanasi secara kering (Waluyo, 2005).

Faktor yang mempengaruhi keberhasilan sterilisasi sistem batch adalah temperatur dan lama pemanasan. Proses pemusnahan mikroba kontaminan dapat digambarkan sesuai reaksi kimia orde satu yang memenuhi persamaan kinetika :

  1. Dimana N adalah jumlah sel yang hidup pada waktu t tertentu, t adalah lama sterilisasi dan Kd adalah konstanta laju kematian spesifik. Dengan memplot nilai terhadap t, maka didapat garis lurus dengan kemiringan – K­d. pada kematian mikroorganisme secara sterilisasi juga berlaku persamaan Arhenius yang menunjukkan bahwa temperatur mempengaruhi konstanta laju kematian spesifik.
  2. Dimana A adalah konstanta Arhenius, Ea adalah energi aktivasi, dan R adalah konstanta gas dan T adalah temperatur absolut pemanasan. Dari persamaan ini terlihat bahwa laju reaksi kematian sel akan meningkat jika temperatur sterilisasi meningkat karena peningkatan temperatur menyebabkan peningkatan Kd. nilai Ea dan Kd didapat dari hubungan pada persamaan Arhenius tersebut dengan cara mengalurkan ln Kd terhadap 1/T (Achmad, 2007).

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain:

  1. harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba,
  2. harus mempunyai tekanan osmosis,
  3. tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh,
  4. tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba,
  5. harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Sutedjo, 1991).

Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agar-agar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang diekstraksi dari alga marin genus Gelidium, namun sebagian besar mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).

Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan indikator. Komposisi media bakteri dapat dimodifikasi sehingga dapat digolongkan menjadi media umum, media selektif (bakteri tertentu saja yang dapat tumbuh) dan media diferensial (bakteri tumbuh dengan memberikan ciri-ciri tertentu) (Achmad, 2007).

Media alamiah, misalnya susu skim, tidak begitu sulit di dalam penyiapannya sebagai media pertumbuhan mikroba, karena hanya cukup dengan dituang ke dalam wadah yang telah disterilkan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar, disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada praktisnya, semua media tersebut secara komersial dalam bentuk bubuk, seperti PCA (Plate Count Agar), NA (Nutrient Agar), TSA (Trypticase Soy Agar) dan lain-lain. Bakteri, dari kata latin bacterium (jamak, bacteria) adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus (inti sel), Cytoskelen, dan organik lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena bakteri merupakan prokaryota, untuk membedakan dengan organisme lain yang memiliki sel yang lebih kompleks, disebut eukaryota. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya berukuran 0.5 – 5 µm, meskipun akan ada juga jenis yang dapat menjangkau 0.3 mm dalam diameter (Thiomargarita) (Rachdie, 2006).

III. Alat

  1. Cawan Petri,
  2. Erlenmeyer,
  3. Tabung reaksi,
  4. Otoklaf,
  5. Pipet mohr,
  6. Sudip,
  7. Neraca analitik,
  8. Magnetic stirer,
  9. Hot plate dan
  10. Rak tabung reaksi

IV. Bahan

  1. Akuades,
  2. Nutrient Agar (NA),
  3. Potato Destroxe Agar (PDA) dan
  4. MEA (Malt Extract Agar).

V. Prosedur Kerja

Standarisasi Praktikum

  1. Periksa autoclave dengan melihat kondisi aquades dibagian bawah dan kondisi umum autoclave (kebersihan, kabel, dll).
  2. Bungkus alat-alat gelas dan non gelas dengan kertas cokelat dengan cara sedemikian mungkin.
  3. Masukkan semua bahan dan alat kedalam keranjang sterilisasi dengan mengatur posisi yang mantap.
  4. Tutup autoclave dengan memutar alat penutup sesuai direksi manualnya.
  5. Setting waktu dan suhu.
  6. Kemudian tekan “START”.
  7. Tunggu sampai alarm berbunyi dan matikan dengan tekan tombol on/off dan cabut kabel.
  8. Ingat biarkan sampai tanda indikator tekanan betul-betul menunjukkan angka nol.
  9. Jangan dibuka sembarangan, jika tidak mengikuti aturan, autoclave akan meledak layaknya bom.
  10. Hati-hati dalam bekerja. Jika tidak tahu, tanyakan ke petugas laboratorium.

 Pembuatan Media NA dan Sterilisasi

  1. 1,2 gram nutrien agar (NA) ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
  2. Ditambahkan 50 mL akuades.
  3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat.
  4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi.
  5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan karet gelang.
  6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang akan digunakan selama 2 jam pada suhu 121̊C dan tekanan 15 psi.

 Pembuatan Media PDA dan Sterilisasi

  1. 1,95 gram potato destroxe agar (PDA) ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
  2. Ditambahkan 50 mL akuades.
  3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat.
  4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi.
  5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan karet gelang.
  6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang akan digunakan selama 2 jam pada suhu 121̊C dan tekanan 15 psi.

 Pembuatan Media MEA (Malt Extract Agar) dan Sterilisasi

  1. 2,4 gram MEA ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
  2. Ditambahkan 50 mL akuades.
  3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat.
  4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi.
  5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan karet gelang.
  6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang akan digunakan selama 2 jam pada suhu 121̊ C dan tekanan 15 psi.

VI. ANALISIS DATA

Pembuatan Media NA dan Sterilisasi

  1. Tentukan komposisi Nutrient Agar (20 gr/L).
  2. Tentukan warna sesudah sterilisasi.

 Pembuatan Media PDA dan Sterilisasi

  1. Tentukan komposisi Potato Destroxe Agar (39 gr/L).
  2. Tentukan warna sesudah sterilisasi.

 Pembuatan Media Media MEA dan Sterilisasi

  1. Tentukan komposisi Malt Extract Agar (48 gr/L).
  2. Tentukan warna sesudah sterilisasi

VII. Pertanyaan

  1. Apa fungsi dari media tanam mikroba?
  2. Apa saja syarat-syarat pemilihan medium tanam mikroba?
  3. NA, PDA, dan MEA termasuk media penanaman mikroba jenis apa?
  4. Apa fungsi dari sterilisasi?
  5. Apa saja teknik-teknik dalam proses sterilisasi?

Daftar Pustaka
Achmad, D,. 2007, Media Agar. Ide Besar Istri Peneliti, http://www.nvtech.com , Diakses tanggal 1 November 2010

Hadioetomo, RS, 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Gramedia: Jakarta

Rachdie, 2006, Mengenal Media Pertumbuhan Mikrobia, http://rachdie.blogsome.com/2006/10/18/mengenal-media-pertumbuhan-mikrobial/tracback , Diakses tanggal 1 November 2010

Sutedjo, 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta: Jakarta

Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi kelima, Erlangga:  Jakarta

Waluyo, L., 2005, Mikrobiologi Umum, UMM Press: Malang

Tinjauan Pustaka

Kepala Laboratorium Pendidikan Kimia, Fakultas Matematika dan ilmu pengetahuan alam, Universitas Islam Indonesia, Panduan Penulisan  Laporan Praktikum

Editing, ahmad, M., Laporan Praktikum Teknik Sterilisasi dan Pembuatan Media   Kuliah Mikrobiologi, http://proseduralatpengujiansnikualitaskadar.blogspot.com/2011/01/laporanpraktikum-teknik-sterilisasi.html

About these ads

Berikan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s